- Что относят к иммунологическим методам?
- Метод ИФА
- «Классическая» методика
- Модификации ИФА
- Вестерн-блоттинг
- Иммунохроматография (ИХА)
- Иммуногистохимия
- Проточная цитометрия
- Хемилюминесценция
В течение миллионов лет иммунная система создавала различные инструменты для борьбы с патогенами. Результатом стала чрезвычайно сложная система защиты организма от инфекций и других чужеродных агентов (мутировавших клеток, инородных предметов и веществ). Современные методы исследования в иммунологии позволяют глубже изучить эту систему, диагностировать различные заболевания на ранней стадии.
Что относят к иммунологическим методам исследования?
Основой практически всех иммунологических методов исследования являются специфические реакции антиген/антитело. Антитела – один из основных белков иммунной системы, их функции:
- Распознание чужеродных молекул;
- Их маркировка;
- Нейтрализация вирусов.
Именно способность антител избирательно соединяться с чужеродными молекулами (антигенами) позволила создать современные высокоточные методы диагностики в иммунологии.
Метод ИФА
Иммуноферментный анализ используется для обнаружения в растворе определенного белка, дает информацию об его количестве. Метод пришел на смену устаревшему радиоиммунному анализу, в котором использовались меченные радиоактивными изотопами антитела.
Благодаря относительной простоте, высокой чувствительности и специфичности ИФА лежит в основе большинства экспресс-тестов к возбудителям различных инфекций. Также он широко применяется в аллергологии для определения веществ, на которые реагирует иммунная система.
«Классическая» методика
В настоящее время наиболее распространен твердофазный ИФА, это один из самых популярных лабораторных методов исследования в иммунологии. Для его проведения используют специальные планшетки с лунками, заполненными адгезивным пластиком. В нем заранее осаждают специфические антитела и особый фермент, которые при реакции антиген/антитело изменяет свой цвет.
Для проведения анализа в лунку добавляют плазму крови либо другие анализируемые жидкости. Если реакция оказалась положительной субстрат изменит свой цвет, по степени окраски можно очень точно подсчитать количество прореагировавших антигенов.
Модификации ИФА
Существует множество различных вариантов проведения этой реакции в зависимости от целей, стоящих перед исследователями. К самым распространенным относятся:
- Сэндвич-ИФА. Метод позволяет определять наличие даже очень небольшого количества антигенов. Для этого после добавления антигена в лунку, вносят еще некоторое количество антител, затем эту операцию повторяют нужное количество раз. Это позволяет создать послойную структуру антиген-антитело, несколько напоминающую сэндвич.
- Конкурирующий ИФА. Применяется для обнаружения в крови специфических антител. Для этого в лунки планшета вносят антиген, к которому добавляют плазму крови, смешанную с меченными антителами, специфичными для этого антигена. Чем больше антител из плазмы прореагирует с антигеном, тем слабее будет изменение цвета лунки, так как они не несут на себе фермента, изменяющего цвет в процессе реакции.
- Мультиплексная ИФА. Позволяет одновременно определить содержание в образце сотен разнородных белков. Был создан так как объекты и методы исследований в иммунологии требуют детального отслеживания концентрации большого количества компонентов, что сложно реализовать другими способами. В мультиплексной ИФА в одной лунке содержаться множество полимерных сфер микроскопических размеров, на поверхности которых размещены специфические антитела и ферменты (как в классической ИФА). Для изучения результатов реакции используют специальное оборудование, способное точно отследить изменения цвета разных микросфер
Вестерн-блоттинг
Принципиально метод мало отличается от ИФА. При его использовании также происходит обнаружение реагирующих с определенными антителами белков. Существенных различий два:
- Осаждение антител происходит на нитроцеллюлозной мембране. На ней же и протекает реакция при добавлении исследуемого раствора;
- Для визуализации результата добавляют фермент, способный светиться при протекании реакции антиген/антитело.
За счет использования «светящихся» ферментов вестерн-блоттинг позволяет получать серии снимков с различной экспозицией. Это полезно, если нужно отследить динамику протекания реакции в различных условиях.
Важное преимущество вестерн-блоттинга – мембрану можно использовать повторно, достаточно «отмыть» вторичные антитела.
Иммунохроматография (ИХА)
Современный метод исследования в иммунологии легший в основу огромного количества экспресс-тестов. ИХА используется в тестах на беременность, для быстрого обнаружения в крови наркотических веществ.
Реакция протекает в тест-полоске, содержащей заранее внесенные антитела и ферменты-красители. При смачивании ее биологической жидкостью (кровь, слюна, моча и т. д.) она начинает мигрировать вдоль нее, смешиваясь с антителами. Если в исследуемом образце есть соответствующий белок – он свяжется с антителами и при достижении слоя, содержащего краситель – произойдет реакция и тест-полоска изменит свою окраску.
Хотя ИХА достаточно чувствительный метод, он позволяет только судить о наличии определенного белка в образце о его концентрации они информацию не дает. С этим связано ограниченное применение в виде доступных экспресс-тестов.
Иммуногистохимия
Объектом этого метода исследований в иммунологии являются специфические антигены в тканях либо непосредственно на поверхности клеток. Он получил широкое распространение в онкологии так как позволяет точно определить тип опухоли, стадию ее развития и вероятность наличия метастазов.
Порядок проведения:
- Полученные при биопсии либо после операции ткани замораживают и покрывают парафином. Затем выполняется микротомирование – образец нарезается очень тонкими слоями (толщиной до 18 мкм);
- Полученный срез размещают на предметном стекле, блокируют неспецифичные антигены путем «забивки» – добавлением сывороточного альбумина;
- К образцу добавляют специфические антитела, помеченные флуоресцентным веществом;
- Срез изучают при помощи флуоресцентного микроскопа либо фотоэлемента.
Для проведения различных научных исследований используют другой вариант этой методики – имумноцитохимию. При этом изучается наличие антигенов непосредственно внутри клетки. Исследователи получают возможность получить ценную информацию о процессах, протекающих в ней.
Проточная цитометрия
Это один из самых высокотехнологичных современных методов исследования в иммунологии. Позволяет провести точное иммунофенотипирование клеток, определить наличие определенных белков внутри клетки и на поверхности ее мембраны. В медицине используется для диагностики опухолей, точной оценки состояния иммунной системы и ее клеточного звена.
Для проведения анализа суспензию содержащую анализируемые клетки смешивают с меченными антителами и флуоресцентными ферментами. Затем создается направленный поток жидкости, параметры которого подобраны так, чтобы клетки выстроились в один ряд. Это достигается двумя путями:
- Акустическое фокусирование. Клетки выстраиваются в определенном порядке под воздействием специально подобранных звуковых волн;
- Гидродинамическое фокусирование. Тот же результат получают путем изменений параметров движения суспензии, содержащей исследуемые клетки.
После фокусировки клетки поступают в проточную ячейку, в которой их облучают при помощи лазера. Ответные световые сигналы регистрируются чувствительным фотоэлементом и преобразуются в цифровой сигнал. В дальнейшем его анализируют путем обработки в специальном программном обеспечении.
Хемилюминесценция
Метод диагностики в иммунологии который осуществляется за счет анализа свечения биологической пробы. Суть его состоит в регистрации светового излучения, возникающего в момент реакции антиген/антитело. Любая такая реакция сопровождается свечением, но интенсивность его крайне мала.
Для усиления светового потока используют особые вещества – люминофоры. Если в их присутствии происходит иммунная реакция, происходит возбуждение определенных частей молекулы люминофора, затем их стабилизация. При этом «лишняя» энергия выделяется в виде фотонов. Чем больше антител прореагировало – тем сильнее будет поток сгенерированного люминофором света.
Существуют и другой тип индикаторов, используемых в хемилюминесценции. Они сами не светятся, но усиливают природное свечение иммунных реакций. Чаще всего в качестве такого усилителя используют соединения кумарина, они способны усиливать естественную хемилюминесценцию в тысячи раз.
Хемилюминесценцию используют для изучения процессов фагоцитоза, нюансов работы защитных систем клеток. В медицине методику применяют для получения данных о воспалительных реакциях и наследственных заболеваниях.